حفظ العزلات البكتيرية باستخدام الجلسرين والتجميد العميق يُعد حفظ العزلات البكتيرية من الممارسات الأساسية في مختبرات الأحياء الدقيقة، لما له من دور محوري في ضمان استمرارية الدراسات البحثية والتطبيقات التشخيصية. ويتطلب ذلك الحفاظ على الخصائص الوراثية والفسيولوجية للعزلات دون حدوث تغيرات ملحوظة مع مرور الزمن. تُعتبر تقنية الحفظ باستخدام الجلسرين والتجميد العميق (Glycerol Cryopreservation) من أكثر الطرق كفاءة وانتشارًا، نظرًا لقدرتها على الحفاظ على حيوية الخلايا البكتيرية لفترات طويلة مع الحد الأدنى من التغيرات البنيوية والوظيفية. المبدأ العلمي تعتمد هذه الطريقة على استخدام الجلسرين كمادة واقية من التجميد (Cryoprotectant)، حيث يعمل على تقليل الأضرار الناتجة عن تكوّن البلورات الجليدية داخل الخلايا أثناء عملية التجميد. عند تجميد الخلايا في غياب مواد واقية، يؤدي تكوّن بلورات الثلج إلى تمزق الأغشية الخلوية وتعطيل المكونات الحيوية. أما في وجود الجلسرين، فيتم: ا-  ب- خفض نقطة تجمد الوسط ت- تقليل تكوّن البلورات الجليدية ث- الحفاظ على سلامة الغشاء الخلوي ج- تقليل الإجهاد الأسموزي  وبذلك تزداد قدرة الخلايا على البقاء حية خلال فترات التخزين الطويلة. الآلية الحيوية يعمل الجلسرين عبر عدة آليات متكاملة، من أهمها: 1. النفاذ إلى داخل الخلية: يتميز الجلسرين بقدرته على الانتشار عبر الغشاء الخلوي، مما يسمح له بالتوازن بين الوسطين الداخلي والخارجي. 2. منع التبلور الضار: يساهم في تكوين حالة شبه زجاجية (Vitrified state)، مما يقلل من تكوّن البلورات الحادة التي قد تُتلف البنية الخلوية. 3. تقليل فقدان الماء: يحد من انتقال الماء خارج الخلية أثناء التجميد، مما يقلل من الانكماش الخلوي. 4. تثبيت الجزيئات الحيوية: يحافظ على استقرار البروتينات والإنزيمات، ويمنع تغير بنيتها الفراغية. طريقة العمل (الإجراءات العملية) 1. تحضير المزرعة البكتيرية ⋅ تُزرع العزلة البكتيرية في وسط سائل مناسب (مثل Nutrient broth أو LB broth). ⋅ تُحضن تحت الظروف المثلى حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي أو الثابت. 2. تحضير محلول الجلسرين ⋅ يُستخدم جلسرين معقم بتركيز نهائي يتراوح بين 15–25%، ويُعد تركيز 20% الأكثر شيوعًا. 3. إعداد العينة ⋅ يُمزج حجم محدد من المزرعة البكتيرية مع الجلسرين المعقم بنسبة مناسبة لتحقيق التركيز النهائي المطلوب. ⋅ يتم الخلط بلطف لضمان تجانس العينة دون إحداث ضرر ميكانيكي للخلايا. 4. التخزين بالتجميد ⋅ تُوزع العينات في أنابيب معقمة (Cryovials). تُحفظ عند: ⋅ -20 درجة مئوية للتخزين قصير الأمد ⋅ -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد *ويُفضل التجميد السريع لتقليل فرص تكوّن البلورات الجليدية الكبيرة. النتائج المتوقعة عند تطبيق هذه التقنية بصورة صحيحة، يمكن تحقيق ما يلي: ⋅ الحفاظ على نسبة عالية من حيوية الخلايا البكتيرية ⋅ ثبات الخصائص الوراثية والفينوتيبية ⋅ إمكانية التخزين لفترات طويلة قد تمتد لسنوات ⋅ تقليل الحاجة إلى إعادة الزرع المتكرر، مما يقلل من خطر التلوث أو حدوث الطفرات إعادة إنعاش البكتيريا (Revival) تتم عملية استرجاع العزلات البكتيرية وفق الخطوات التالية: 1. إخراج العينة من المجمد بسرعة 2. أخذ كمية صغيرة باستخدام أداة معقمة دون إذابة العينة بالكامل 3. زرعها مباشرة على وسط زرعي صلب مناسب 4. حضنها في الظروف البيئية الملائمة لنموها ملاحظات مهمة: يُنصح بتجنب تكرار دورات التجميد والذوبان يُفضل تقسيم العينة إلى أجزاء صغيرة (Aliquots) عند التحضير قد تتطلب بعض الأنواع البكتيرية ظروف إنعاش خاصة المقارنة مع طرق الحفظ الأخرى تتميز طريقة الجلسرين والتجميد بما يلي: ⋅ سهولة التطبيق ⋅ انخفاض التكلفة ⋅ كفاءة عالية في الحفاظ على الحيوية مقارنةً بطرق أخرى مثل: الحفظ على الأوساط الصلبة (قصير الأمد) التجفيف بالتجميد (Lyophilization) الذي يوفر استقرارًا أعلى لكنه يتطلب تجهيزات متقدمة وتكلفة أكبر الخلاصة تُعد تقنية حفظ العزلات البكتيرية باستخدام الجلسرين والتجميد العميق من أكثر الطرق موثوقية وكفاءة في المختبرات الحديثة. فهي توفر توازنًا مثاليًا بين الحفاظ على حيوية الخلايا واستقرارها الوراثي، مع سهولة التطبيق وانخفاض التكلفة. وتبقى دقة التنفيذ والالتزام بالإجراءات القياسية العامل الحاسم في ضمان نجاح عملية الحفظ واسترجاع العزلات بكفاءة عالية عند الحاجة. جامعة المستقبل الجامعة الاولى في العراق قسم تقنيات المختبرات الطبية الاول في التصنيف الوطني العراقي